四噻唑藍(lán)(methylthiazoletetrazolium，MTT)法被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的檢測(cè)。MTT為黃色化合物，可被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成不溶于水的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臌(formazan)，后者沉積在細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞則無(wú)此酶活性而無(wú)此過(guò)程。在一定細(xì)胞敷范圍內(nèi)甲躦結(jié)晶的形成量與活細(xì)胞數(shù)成正比。生成的結(jié)晶產(chǎn)物可被二甲基亞砜(DMSO)溶解(也可以用含50％的N，N一二甲基甲酰胺和20％的pH 4．7的十二甲基磺酸鈉的MTT溶解液溶解)，利用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細(xì)胞數(shù)目。

(一)材料

．待測(cè)細(xì)胞：96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24~72h的成層細(xì)胞。(按04／200μl／孔接種細(xì)胞)。

2．MTT溶液：5mgMTT溶于lml培養(yǎng)液(與所用的培養(yǎng)細(xì)胞液相同，不含酚紅)、

3．0mol／L PBS(pH7．2)或生理鹽水中。0．2μm濾膜除菌后，分裝，4℃保存，兩周內(nèi)有效。凍存可保存更長(zhǎng)時(shí)間。使用時(shí)可配成2mg／ml濃度。MTT粉末和溶液均需避光保存。

3．DMSO(分析純)。

4．96孔培養(yǎng)板，可調(diào)移液器，吸管，離心管。

5．CO2孵箱，顯微鏡，微型振蕩器，酶標(biāo)儀。

(二)方法

．棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)液。

2．每孔中加入50μl(2 mg／ml)MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～4h。

3．終止培養(yǎng)，小心吸棄(或倒置培養(yǎng)板)孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，如為懸浮細(xì)胞離心后吸棄上清液。每孔加入50μl DMSO，在微型振蕩器上震蕩5~0min，使結(jié)晶充分溶解。

4．比色：選擇490nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值(OD值)，記錄結(jié)果。

(三)結(jié)果分析

    細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值÷對(duì)照組吸光度值×00％。如果是藥物試驗(yàn)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制率曲線。

    繪制生長(zhǎng)曲線：以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

(四)注意事項(xiàng)

．選擇合適的細(xì)胞濃度，培養(yǎng)終止時(shí)細(xì)胞密度不宜過(guò)大，這樣才能保證MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)呈良好的線性關(guān)系。

2．避免高濃度的血清物質(zhì)影響實(shí)驗(yàn)孔的光吸收值，一般選低于0％胎牛血清的培養(yǎng)液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3．設(shè)空白對(duì)照。與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔，其他試驗(yàn)條件保持一致，比色時(shí)，以空白對(duì)照孔調(diào)零。